Seit mehr als 10 Jahren werden in cGMP-Richtlinien die Erwartungen hinsichtlich der kontinuierlichen mikrobiologischen Prozessluftüberwachung in Klasse A- (ISO 5) und Klasse B- (ISO 7) Bereichen hervorgehoben, wobei auf die Sedimentationsplatten-Methode verwiesen wird. Da sie jedoch auf dem schwerkraftbedingten Auftreffen von Partikeln auf eine Oberfläche beruhen, gelten Sedimentationsplatten als nicht validierbare Methode.

Reinräume sind kontrollierte Bereiche, in denen der Kontaminationsgrad einem definierten Reinheitsgrad entsprechen muss. In GMP-definierten Reinräumen ist die mikrobielle Kontamination ein kritischer Parameter, den es zu kontrollieren gilt. Die Sterilitätssicherung für als steril gekennzeichnete Produkte kann durch eine Endsterilisation des Endprodukts erreicht werden. Zu diesen Produkten gehört unter anderem ein großer Teil steriler Medikamente, welcher jedoch in den herkömmlichen Sterilisationsprozessen instabil ist und deshalb eine aseptische Verarbeitung erfordert. Es wird von den Behörden anerkannt, dass die aseptische Fertigung für das Endprodukt ein höheres Kontaminationsrisiko als der End-Sterilisationsprozess darstellt.
Zur Minderung dieses Risikos haben die Aufsichtsbehörden den Pharmaunternehmen dringend empfohlen, eine Lösung zu implementieren, bei der sterile Produkte vom Personal getrennt werden. Dies hat zu den Barrieresystemen geführt, wie sie heute in sterilen pharmazeutischen Fertigungen weit verbreitet sind.
Mit neuen Technologien lässt sich der Grad der mikrobiellen Kontamination im Reinraum kontinuierlich und zuverlässig überwachen. Allerdings verweisen die gängigen GMP-Richtlinien zur Definition der Grenzwerte für die mikrobielle Verunreinigungen nach wie vor auf die Sedimentationsplatte mit 4-stündiger Probennahme und traditionelle, wachstumsbasierende mikrobiologische Lösungen bleiben der gängigste Ansatz zur Luftüberwachung. Pharmazeutische Hersteller verwenden für den Nachweis der kontinuierlichen Probennahme zur mikrobiellen Kontamination überwiegend Sedimentationsplatte, selbst wenn die „kontinuierliche“ Sammlung eines Kubikmeters Luft, die häufigste Variante, oft nicht länger als 40 min dauert. Hinzu kommt, dass die natürlichen Einschränkungen durch Wachstumsmedien, häufig nur kurze mikro­bielle Überwachungen erlauben.

Größenverteilung der Luftpartikel und Wirksamkeit von Sedimentationsplatten
Organische und nicht-organische luftgetragene Partikel variieren in ihrer Größe, Form und Dichte. Ohne eine Standardreferenz für luftgetragene Partikel werden allgemeine Annäherungen wie der geometrische Äquivalentdurchmesser verwendet, um Werte für die Größe, Form und Dichte eines Partikels zu erhalten.
Der Äquivalenzdurchmesser entspricht in diesem Fall dem Durchmesser einer Kugel mit gleicher geometrischer Eigenschaft, die sich in der Luft mit der gleichen Geschwindigkeit absetzt, wie das betrachtete Partikel. Anhand dieser Schätzung wird die Wirksamkeit der mikrobiellen Überwachungsmethoden, d. h. die Wiederfindung an Mikroorganismen bestimmt. Beispielsweise wurde die Ausbeute der Sedimentationsplatte vor einigen Jahren auf Grundlage standardisierter Parameter für statische Bedingungen der Umgebungsluft geschätzt. Diese Parameter bieten eine nur unzureichende Darstellung kritischer pharmazeutischer Reinraumumgebungen, in denen dynamische Bedingungen vorherrschen (z. B. mehrere Luftwechsel pro Stunde je nach Klassifizierung).

Berechnung der Absetzgeschwindigkeit von Luftpartikeln
Ein kugelförmiges, ungeladenes Partikel ohne Trübungssedimente mit konstanter Geschwindigkeit gemäß der folgenden Formel (1):
Dabei steht Vc für die Kontaminationsgeschwindigkeit (d. h. die Absetzgeschwindigkeit einer KbE), r für den Partikelradius, g für die Beschleunigung aufgrund der Schwerkraft, p für die Partikeldichte, pa für die Luftdichte und ɳ für die Luftviskosität.
Zwischen 2015 und 2016 veröffentlichten Whyte et al. eine Reihe von Artikeln, in denen sie sich mit der Ablagerung von luftgetragenen Partikeln auf kritischen Oberflächen in Reinräumen befassten [1-4]. Als wichtige Mechanismen für die Ablagerung wurden Gravitationsablagerung, Turbulenzablagerung, elektrostatische Anziehung und bei Partikeln unter 0,5 µm, die brownsche Bewegung festgestellt. Kleinere Partikel werden mit höherer Wahrscheinlichkeit aus dem Reinraum transportiert und erhalten kaum Zeit zur Ablagerung, während sich größere Partikel weiterhin durch Schwerkraft ablagern. Ein Anstieg in der Intensität der Luftturbulenz kann dazu beitragen. Bei einem Partikelgrößenbereich zwischen 5 und 30 μm und bei Anwendung auf eine ISO-Klasse 5 ging man von einer Steigerung der Ablagerungsgeschwindigkeit um das Fünffache aus. Für Partikel mit einer Größe von 0,3 oder 0,5 µm wurde eine geringere Beeinflussung durch die Schwerkraft erwartet.
Es wurde festgestellt, dass sich die Ablagerungsgeschwindigkeit mit zunehmender Reinheit des Reinraums erhöhte [4]. Die Ergebnisse der Studie sind in Tabelle aufgeführt:

Effizienz von aktiven Luftkeimsammlern
In ISO 14698:2003 Anhang B wird ein Verfahren zur Bestimmung der Sammeleffizienz von Luftkeimsammlern hinsichtlich zweier Aspekte betrachtet: die physikalische Effizienz und die biologische Effizienz.

• Die physikalische Effizienz ist die Fähigkeit, bei der Probennahme verschiedene Partikelgrößen zu erfassen.
• Die biologische Effizienz ist die Effizienz der Proben­nahme hinsichtlich der Wiederfindung von keim­tragenden Partikeln (MCP).

Die physikalische Effizienz ist für nicht-mikrobielle Partikel, keimtragende Partikel und luftgetragene Keime gleich. Die biologische Effizienz wird als geringer angenommen als die physikalische Effizienz, da sie abhängig ist vom  Überleben der gesammelten Mikroorganismen sowie von dem Sammelmedium, auf dem sie dann wachsen. Die in Anhang B der Norm beschriebene Testmethode bezieht sich vorwiegend auf die physikalische Effizienz.
Die experimentelle Methode zur Bestimmung der physikalischen Effizienz beinhaltet ein Testaerosol, das in einer Testkammer erzeugt und gestreut wird (bei definierter relativer Luftfeuchtigkeit und Temperatur). Das Testaerosol kann mit Bacillus subtilis var. niger (NCTC 10073)-Sporensuspension, durch Polystyrolkugeln oder andere Arten von nicht-organischen Partikeln erzeugt werden. Trotz ähnlicher Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass bei einigen Sammlern nicht alle anorganischen Partikel erkannt werden können. Bei Verwendung von Mikroorganismen hingegen wachsen diese zu Kolonien heran, die leicht sichtbar und identifizierbar sind.
Zur Bestimmung der biologischen Effizienz kann Staphylococcus epidermidis (NCTC11047 – ATCC 14990) verwendet werden, mit dem sich ein humaner Kontaminationsstamm darstellen lässt. Aufgrund der Schwankungen der Sammeleffizienz, bedingt durch das Spritzen der Lösungen und die Sammelbedingungen, gilt diese Methode als weniger zuverlässig als die Methode zur Bestimmung der physikalischen Effizienz.
Jeder Test muss parallel mit einem Referenzsystem (Membranfilter und Luftkeimsammler) durchgeführt werden, um die Effizienz des Probennehmers zu erhalten [5]:

In ISO 14698:2003 Anhang A hängt die Auswahl des in einer Gefahrenzone zu verwendenden Luftkeimsammlers vom Zweck der Probennahme ab. Darüber hinaus sollte das Gerät eine Aufprallgeschwindigkeit (Geschwindigkeit der Luft, die auf das Kulturmedium trifft) aufweisen, die einen Kompromiss darstellt zwischen:

• einer Geschwindigkeit, die so hoch ist, dass sie das Erfassen organischer Partikel bis herunter ca. 1 µm ermöglicht und
• einer nicht zu hohen Geschwindigkeit, sodass die Lebensfähigkeit von Partikeln gewährleistet bleibt, indem mechanische Schäden oder das Aufbrechen von Bakterienklumpen oder Mikromyzeten vermieden werden.

In der Life-Science-Branche bestand die Empfehlung des ISO-Standards im Allgemeinen in einem Keimsammler mit einer physischen Ausbeute von oder nahezu 50 % bei einer Partikelgröße von ca. 1 µm (d50-Wert von 1 µm) und Keimsammler mit einem d50-Wert von ca. 1 µm sind weithin anerkannt. Wenn nun bekannt ist, dass keimtragende Partikel in Aerosolen eine Größe von 10 bis 20 µm haben, warum ist eine gute Leistung bis zu 1 µm dann wichtig? Kleine Partikel sind schwieriger aufzufangen als größere Makropartikel (Partikel größer als 5 µm) und 1 bis 3,0 µm entspricht der Größe der häufigsten Einzelbakterien.

Wie werden Partikel von aktiven ­Keimsammlern erfasst?
Wenn ein Gasstrom eine scharfe Richtungsänderung durchläuft, neigen die transportierten Partikel mit steigendem Verhältnis ihrer Masse zu ihren linearen Abmessungen dazu, sich in ihre ursprüngliche Richtung weiter zu bewegen. Partikel mit unterschiedlichen Abmessungen und Dichten folgen unterschiedlichen Bahnen und können separat gesammelt werden. Wenn ein Luftstrahl in einer Düse beschleunigt wird, werden die von ihm transportierten Partikel mit der gleichen Geschwindigkeit wie das umgebende Medium (Luft)  befördert und folgen ihrer Flusslinie. Wenn sich die Strömungslinien am Düsenausgang schnell ändern, trennen sich die Partikelbahnen in Abhängigkeit von der Trägheit der Partikel deutlich von den Luftströmungslinien. Anders ausgedrückt folgen die Partikel einer geraden Linie, und wenn sie auf ihrem Weg auf eine Oberfläche treffen, können sie daran anhaften und somit aufgefangen werden.
Aktive Luftkeimsammler (Impaktoren) sind so konzipiert, dass sie Partikel aus der Luft aufnehmen, indem diese mit einer festen Oberfläche kollidieren. Die Geometrie des Impaktors (W, T, S) ist so gestaltet, dass laminare Strömung in die Düse (Re < 2300) fließt, die Geschwindigkeit möglichst hoch und der d50-Wert so niedrig wie möglich liegt.

Sedimentationsplatten und die Alternative
Sedimentationsplatten liefern Hinweise auf mikro­bentragende Partikel, deren durchschnittlicher Durchmesser mit über 10 µm angenommen werden kann. In ISO 14698-1:2003 Anhang C besagt die Definition der Sedimentationsplatte, dass passive Luftkeimsammler wie z. B. Sedimentationsplatten  nicht die Gesamtzahl der organischen Partikel in der Luft messen, sondern vielmehr die Rate, mit der sich organische Partikel auf Oberflächen ablagern.
Sedimentationsplatten werden zur kontinuierlichen Luftkeimüberwachung in kritischen Bereichen empfohlen, da sie im Gegensatz zu aktiven Keimsammlern nur begrenzte Handhabung erfordern. Zur Vereinfachung und Reduktion der Handhabung bei gleichzeitiger Verringerung des Kontaminationsrisikos für den Bediener bilden Einweg-Impaktoren die ideale Alternative. Sofern der Hersteller die ISO-Anforderungen und Best Practices für Labore einhält, können sie auch eine zuverlässige Lösung für die Langzeitproben­nahme darstellen.

Sedimentationsplatten im Vergleich zur kontinuierlichen aktiven Luftkeim­sammlung
Aufgrund ihrer geringen Empfindlichkeit und der fraglichen Bedeutung der resultierenden Daten werden für Bereiche der Klasse A keine Sedimentationsplatten empfohlen. Sedimentationsplatten sind nur für Bereiche der Klassen B, C und D zulässig, in denen die Luftbewegung (Turbulenzen) eine stärkere Ablagerung von keimtragenden Partikeln ermöglicht.
Bei der Verwendung von moderne Reinraumanzügen für das Personal in aseptischen Bereichen werden keimtragende Partikel mit einem Größenbereich von 0,5 bis 5 µm erwartet. Die kontinuierliche aktive Luftkeimsammlung ersetzt die Verwendung von Sedimentationsplatten und die einzelne oder intermittierende aktive Luftkeimsammlung für Bereiche der Klasse A. In Tabelle 2 ist der Methodenvergleich dargestellt.

Gründe für die Überwachung unterschiedlicher Reinheitsgrade
Die pharmazeutische Reinraumqualifizierung ist für die Arzneimittelproduktion, in der die Patientensicherheit eine tragende Rolle spielt, von entscheidender Bedeutung. Durch die mikrobiologische Qualifizierung wird ermittelt, ob die Luft während der Herstellung sauber ist. Nach der Qualifizierung und einem positiven Ergebnis müssen Pharmaunternehmen im Rahmen ihrer Strategie zur Kontaminationskontrolle einen Überwachungsplan erarbeiten, der die Luftqualität während der Chargenproduktion gemäß den Spezifikationen, die aufgrund der Validierung festgelegt wurden, dokumentiert und demonstriert.
In die Risikoanalyse der Überwachung von Bereichen der Klasse A (ISO 5-kritische Bereiche) und Klasse B (ISO 7) in der aseptischen Produktion fließen folgende Punkte ein:

• Bereiche der Klasse A umfassen das Produkt, die Materialien mit Produktkontakt und die Kontakt­flächen mit der Umgebung. Besonders kritische Bereiche werden in allen Produktionsphasen kontinuierlich und mit hohen Luftfrequenzen überwacht.
• Der Bereich der Klasse B dient dem Schutz von Klasse A-Umgebungen und erfordert die Anwesenheit von Personal. In diesem Fall hat die mikrobiologische Überwachung eine andere Bedeutung für die Häufigkeit und die Grenzwerte der Messungen. Zweck der Überwachung in diesen Bereichen ist die Kontrolle der mikrobiologischen Kontamination im Rahmen von Spezifikationen und Qualifizierungsergebnissen. Der mikrobielle Trend dieser Bereiche muss bei bekannter, vorhersehbarer Mikrobenflora immer konstant oder leicht abnehmend sein.

Eine kontinuierliche mikrobiologische Luftüberwachung in Klasse A wird bereits von cGMP-Richtlinien gefordert und für das Gesamt-Partikel-Monitoring implementiert. Sie liefert wichtige Informationen zur Menge und Größe der Gesamtpartikel, die an einem bestimmten Probennahmepunkt in der Luft vorhanden sind. Zu den Gesamtpartikeln gehören:

• Inerte Partikel
• Partikel mit Mikroorganismen auf ihren Oberflächen (ohne ihre bekannte Anzahl)
• Mikroorganismen, die selbst Partikel sind und daher vom Partikelzähler erkannt werden können

Die Qualitätssicherung sollte eine Strategie für beide Bereiche mit validierten Methoden (gemäß Arzneibuch oder internationalen Standards) besitzen, um Untersuchungen zu unterstützen und die Bestimmung einer potenziellen Korrelation zwischen Ereignissen zu ermöglichen.
Schlussfolgerungen
In Bereichen der ISO 5/Klasse A, in denen der Luftstrom festgelegt und das Kontaminationsrisiko höher ist, bedeutet der Einsatz einer Sedimentationsplatte aufgrund ihrer niedrigen Empfindlichkeit eine nur unzureichende Überwachungsstrategie. Eine höhere Bedeutung haben Sedimentationsplatten in statischen Umgebungen mit geringen Luftveränderungen, in denen die Ablagerung von Partikeln und Mikroorganismen wahrscheinlicher ist.
Eine kontinuierliche Luftkeimüberwachung in kritischen Bereichen sollte mit validierten Methoden wie z. B. aktiven Luftkeimsammlern erreicht werden. Diese Strategie erfüllt die Auflage der Aufsichtsbehörden hinsichtlich besserer Prozesskenntnisse, einer zuverlässigeren Strategie zur Kontaminationskontrolle und einer wesentlich höheren Sterilitätssicherheit für das freigegebene Produkt.

Literaturverzeichnis
W. Whyte, K. Agricola and M. Derks (School of Engineering, University of Glasgow, UK; VCCN, Dutch Contamination Control Society, Leusden, the Netherlands; Lighthouse Benelux BV, Boven-Leeuwen, the Netherlands) ‘Airborne particle deposition in cleanrooms: Calculation of product contamination and required cleanroom class’ - Clean Air and Containment Review, Ausgabe 26, April 2016
W. Whyte, K. Agricola and M. Derks ‘Airborne particle deposition in cleanrooms: Deposition mechanisms’ - Clean Air and Containment Review – (2015) Ausgabe 24, S. 4-9.
W. Whyte, K. Agricola and M. Derks ‘Airborne particle deposition in cleanrooms: Relationship between deposition rate and airborne concentration’ - Clean Air and Containment Review – (2016) Ausgabe 25, S. 4-10.
W Whyte (School of Engineering, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ) and T Eaton (AstraZeneca, Macclesfield, Cheshire, SK10 2NA) ‘Deposition velocities of airborne microbe-carrying particles’ – European Journal of Parenteral & Pharmaceutical Sciences 2016; 21(2): 45-49.