In Life-Sciences, der chemisch-pharmazeutischen Analytik oder auch in den modernen Materialwissenschaften reichen klassische mikroskopische Verfahren hinsichtlich optischer Auflösung oder Informationsgehalt nicht mehr aus. Daher ist es oft sinnvoll, unterschiedliche Methoden miteinander zu kombinieren, um möglichst umfangreiche Informationen über eine Probe zu erhalten.

Modular aufgebaute, hochauflösende Mikroskopsysteme erschließen interessante Möglichkeiten, da sich unterschiedliche Mikroskopieverfahren wahlweise einzeln oder in Kombination nutzen lassen. Für die in jedem Fall notwendige, hochgenaue und dynamische Probenpositionierung sorgen piezobasierte Scantische, die sich dank ihrer kompakten Bauweise gut in die Mikroskope integrieren lassen.

Die höchstauflösenden Mikroskopiesysteme von Witec sind modular aufgebaut. Dadurch ist es beispielsweise möglich, ein konfokales Ramanmikroskop bei Bedarf mit Rasterkraft-Mikroskopie (AFM) zu kombinieren. Das gleiche Gerät kann dann molekulare Raman- und strukturelle AFM-Informationen derselben Probenregion liefern und in Zusammenhang bringen. Für hochauflösende optische Informationen lässt sich das Mikroskop auch zusätzlich noch mit Nahfeldmikroskopie ausstatten. Dadurch sind ganz nach Bedarf der jeweiligen Anwendung präzise optische, topografische und molekulare Analysen möglich, von denen die unterschiedlichsten Anwendungsbereiche profitieren. Das Einsatzspektrum der modular aufgebauten Hochpräzisionsmikroskope reicht von der pharmazeutischen Forschung und Lebendzell-Untersuchungen über Nanophotonik, Forensik bis hin zu Analysen in Photovoltaik- oder Halbleitertechnik.

Nahaufnahmen unterhalb der Beugungsgrenze

Die optische Nahfeldmikroskopie (Scanning Near Field Optical Microscopy, SNOM) erlaubt die Abbildung von wesentlich kleineren Strukturen, als es mit der konventionellen Mikroskoptechnik möglich ist. Denn bei Letzteren ist die Auflösung durch Beugungseffekte am Objektiv auf rund die Hälfte ihrer Strahlungswellenlänge begrenzt. Anders bei SNOM: Hier koppelt eine Glasfaser Laserlicht in eine innen hohle Messspitze. Das Licht tritt an der Spitze durch eine winzige Öffnung aus, die einen Durchmesser von weniger als 100 nm hat. Wird die Öffnung der Messspitze in geringen Abstand zur Probenoberfläche gebracht, lässt sich so ein Spot deutlich unterhalb der Beugungsgrenze klassischer Mikroskopie beleuchten. Bis zu ca. 60 nm laterale Auflösung sind erzielbar, während der Wert bei konfokaler (Licht)Mikroskopie üblicherweise zwischen etwa 200-300 nm liegt.

Die Probe wird dann Punkt für Punkt abgerastert. Dazu wird sie unter der Messspitze von einem piezogetriebenen, hochauflösenden Scantisch verfahren. An jeder Position nimmt die im Mikroskop integrierte Kamera die ankommende Lichtintensität auf und speichert diesen Wert zusammen mit der Positionsinformation. Daraus wird dann das Bild zusammengesetzt. Auflösung und Genauigkeit des Bildes sind auch von der Positioniergenauigkeit und -Stabilität des Scantisches abhängig.

Informationen über die Oberflächentopologie

SNOM liefert gleichzeitig auch Informationen zur Oberflächentopologie: Da der Abstand zwischen Messspitze und Oberfläche konstant gehalten werden muss und praktisch keine Oberfläche wirklich eben ist, muss die Probenposition in z-Richtung nachgeregelt werden. Diese Aufgabe übernimmt ebenfalls der Scantisch. Dieses Nachregeln liefert topologische Informationen zusätzlich zum optischen SNOM-Bild. Die z-Auflösung der Topografieinformationen ist ungefähr mit AFM vergleichbar. Die laterale Auflösung liegt bei circa 100 nm.

Auch beim AFM-Verfahren wird die Messspitze zeilenweise in einem definierten Raster über die Probenoberfläche geführt. Gemessen werden Kräfte zwischen einer sehr dünnen Messspitze und der Objektoberfläche, die dann Aufschluss über die Topografie der Oberfläche geben. Zudem können Probeneigenschaften wie Adhäsion, Steifigkeit oder Viskosität bestimmt werden. Das laterale Auflösungsvermögen liegt bei 10 nm und darunter. Auch hier wird die Position der Probe in Richtung der z-Achse nachgeregelt. Die Variation der z-Position zusammen mit den für die Ortsauflösung relevanten x- und y-Koordinaten liefern dann die präzisen Topografie-Informationen der Proben.

Der chemische Fingerabdruck

Die Ramanmikroskopie basiert auf einem konfokalen, optischen Mikroskop, kombiniert mit einem Ramanspektrometer. Bei einem konfokalen System werden Blenden verwendet, um Licht außerhalb der Fokusebene des Mikroskops zu unterdrücken. Somit erhält man nur Licht-Information aus der Fokusebene, die zum Spektrometer weitergeleitet wird. Im Spektrometer wird dieses Licht spektral aufgetrennt und detektiert. Die Probe wird Punkt für Punkt und Linie für Linie gescannt. Die laterale Auflösung liegt bei grünem Anregungslicht bei ca. 200 nm. Bei der Messung wird für jeden Bildpunkt ein komplettes Ramanspektrum aufgenommen. Diese Ramanspektren sind für jede Molekülart wie ein spezifischer Fingerabdruck, sodass die chemischen Bestandteile einer Probe für jeden Bildpunkt identifiziert und deren Verteilung in der Probe dargestellt werden können.

Kombiniert man das Raman Imaging mit AFM hat man sowohl hoch aufgelöste topografische als auch molekulare Informationen über die Probenoberfläche. Da die entsprechenden Bilder nacheinander aufgenommen und dann überlagert werden, sind die Anforderungen an den Scantisch extrem hoch. Schließlich ist die präzise Positionierung in allen drei Achsen Voraussetzung für die Genauigkeit des Bildes.

Positionieren mit höchster Auflösung und Dynamik

Die Auflösung muss im Sub-Nanometerbereich liegen, da das beim Scannen eingesetzte Positioniersystem die Ortsauflösung liefert. Gleichzeitig sind die Anforderungen an die Dynamik hoch, denn je schneller die Topographienachführung in z-Richtung erfolgt, desto schneller ist auch die Positionierung in x- und y-Achse möglich. Das verkürzt nicht nur die Messdauer, sondern reduziert auch eventuell vorhandene Temperatur-Drift, die sich zeitabhängig vergrößert. Eine hohe Dynamik kommt damit auch der Genauigkeit zugute.

Bei der Positionierung entschied sich Witec für einen piezobasierten Scantisch von Physik Instrumente (PI). Er ist ausgelegt für Verfahrwege von 100 oder 200 µm in den Achsen der Scanebene und 30 µm in Richtung der z-Achse, ermöglicht eine Positionsauflösung besser als 2 nm und bietet damit beim Einsatz in den modular aufgebauten Mikroskopen für alle drei Verfahren beste Voraussetzungen. Diese sehr hohe Bewegungsauflösung ist nur möglich, weil es bei der Bewegung der Piezoantriebe keine klassischen mechanischen Komponenten gibt, die Reibung oder mechanisches Spiel besitzen.

Stabilität durch kapazitive Sensoren und Digitalelektronik

Die Stabilität bzw. Bahngenauigkeiten während des Scans ist vor allem beim Raman Imaging in Kombination mit AFM wichtig, da die Messungen hier durchaus einige Minuten dauern und auftretende Drift die Aufnahmen verzerren würden. Zusätzlich erhöht die aktive Führung mit Hilfe kapazitiver Sensoren die Bahntreue: Die Sensoren messen eventuelle Abweichungen in der zur Bewegungsrichtung senkrechten Achse. Ein ungewolltes Übersprechen der Bewegung (z.B. durch externe Krafteinwirkung oder mechanisches Übersprechen) in eine andere Achse kann so detektiert und in Echtzeit aktiv ausgeregelt werden.

Die dafür notwendige Steuerung übernimmt ein digitaler Controller. Er ist speziell auf den piezobasierten Scantisch abgestimmt und garantiert auch im dynamischen Betrieb eine gute Linearität. Die Digitalelektronik arbeitet mit hoher Taktrate, denn sie ist entscheidend für genaue Zuordnung der Positionswerte des Scanners und der Aufnahmekamera. Wäre sie zu langsam oder ungenau, gäbe es bei der Zuordnung Auflösungsverlust und Verzerrungen (Jitter). Das piezobasierte Scansystem übernimmt damit eine wesentliche Rolle in den Hochpräzisionsmikroskopen. Dass er sich dank seiner kompakten Abmessungen gut integrieren ließ, kam der beschriebenen Anwendung natürlich ebenfalls entgegen, schließlich ist der Einbauplatz gerade bei Mikroskopen immer knapp bemessen.